Dünnschichtchromatographie – ein kurzer Überblick

Die Dünnschichtchromatographie (DC, engl. Thin layer Chromatography = TLC) dient der analytischen Trennung der Einzelsubstanzen eines Gemischs.

Sie geht auf die Entdeckung der Chromatographie durch den russischen Botaniker M. Tswett zurück, der im Jahre 1903 Pflanzenfarbstoffe (Chlorophylle) voneinander trennte, indem er eine Lösung in Petrolether durch eine Calciumcarbonat-Säule filterte. Die Verlagerung der Chromatographie aus der Säule in eine Sorbensschicht auf einer Trägerplatte geschah ab 1938 und durch die Arbeiten von E. Stahl (1956 – 1960) ist es zu einer Standardisierung der Sorbentien und der gesamten Methode gekommen. In Zusammenarbeit mit den Firmen MERCK und DESAGA wurde die Dünnschichtchromatographie als Verfahren der analytischen Chromatographie eingeführt.

Bei der TLC strömt eine bewegliche (mobile) Phase an einer ruhenden (stationären) Phase vorbei, wobei sich das Gemisch in seine Einzelkomponenten trennt. Für die Trennung verantwortlich sind die physikalisch-chemischen Vorgänge der Adsorption und Verteilung. Die Adsorptionschromatographie kennzeichnet sich dadurch, dass die einzelnen Komponenten eines Gemischs unterschiedlich stark an die Oberfläche der stationären Phase (Sorbens) gebunden, bzw. mit der mobilen Phase (Lösungsmittel) mittransportiert werden. In der Verteilungschromatographie kommt die Trennung zustande, indem sich die Substanzen unterschiedlich stark in zwei begrenzt mischbaren Phasen (flüssige stationäre und flüssige mobile Phase) verteilen.

Platten für die TLC bestehen aus einer Trägerfolie oder Trägerplatte und der Beschichtung mit dem Sorbens. Als Trägermaterialien haben sich Glas, Aluminium und Polyester bewährt. Die Sorbensschicht kann aus Kieselgel, Cellulose, Aluminiumoxid oder Polyamid bestehen, wobei Kieselgel das am meisten verwendete Sorbens ist. Gerade beim Kieselgel gibt es zudem für die verschiedensten Anforderungen spezielle, chemisch modifizierte Varianten.

Für die optimale Trennung der zu untersuchenden Proben kommt es auf die richtige Kombination aus Sorbens und Fließmittel an. Das Fließmittel ist ein Lösemittel(gemisch) und transportiert die Probe durch das Sorbens. Bei der Adsorptionschromatographie ist das Fließmittel auch die mobile Phase. Bei der Verteilungschromatographie bildet an das Sorbens gebundene Wasser die stationäre Phase. Die mobile Phase stellt ein organisches Lösemittel dar.

Ein weiterer Einflussfaktor für das Trennergebnis ist die Kammersättigung. Die meisten Trennungen werden mit Kammersättigung vorgenommen, d.h. der Gasraum in der TLC-Kammer ist mit Fließmitteldämpfen gesättigt.

Die Trennung kann in vertikalen oder horizontalen Kammern stattfinden. Letztere haben den Vorteil, dass nur sehr wenig Fließmittel gebraucht wird, was Kosten spart und die Umwelt schont. Zudem kann man bei den durchsichtigen Trägermaterialien Glas und Polyester den Verlauf der Trennung und die Fließmittelfront sehen.

Nach der Trennung schließt sich eine Trocknung und erste Betrachtung/Dokumentation an. Dazu kommt sichtbares und/oder UV-Licht (254 und 366nm) zum Einsatz. Idealerweise legt man die TLC-Platte dazu in eine Dunkelhaube, die entsprechend illuminiert werden kann und erstellt Bilder mit einer qualitativ hochwertigen Farbkamera. Aber auch einfachere UV-Licht Boxen sind für die schnelle Beurteilung der Trennung einsetzbar.

Je nach untersuchter Probe kann sich nun eine Derivatisierung anschließen, die die Probensubstanzen auf der TLC-Platte chemisch umsetzt und dadurch die Detektion unter den genannten Lichtquellen erst ermöglicht oder erleichtert. Zudem können über diese zusätzlich gewonnenen Informationen Hinweise auf die Substanzidentität erhalten werden. Zur Auftragung der Derivatisierungslösungen gibt es verschiedene Methoden wie Sprühen (Handsprüher, automatischer Sprüher), Tauchen (Tauchkammer) oder Pressen (Klappvorrichtung mit Schwamm). In vielen Fällen ist eine Erhitzung zum Abschluss der Reaktion notwendig. Es können passende Öfen verwendet werden, jedoch bietet es sich an, um den Verlauf einer Farbreaktion zu beobachten zu können, eine Heizplatte zu benutzen. Nach erfolgter Reaktion wird die TLC-Platte erneut betrachtet und dokumentiert.

Für die quantitative Analyse ist es notwendig, die TLC-Platten mit einem Densitometer zu erfassen und auszuwerten. Die Abfolge der Substanzspots, die sich aus einer Probenauftragung ergeben haben, wird Lane genannt. Im Densitometer werden die Lanes mit einem Messstrahl geeigneter Wellenlänge abgefahren und die Absorption oder Fluoreszenz gemessen. Die Signale werden aufgenommen und als Peakkurve entlang der Messstrecke ausgegeben. Diese Kurve wird Chromatogramm genannt. Eine Quantifizierung ist möglich, durch den Vergleich der Peakintensitäten der unbekannten Proben mit denen bekannter Standards. Chromatogramme einer Lane, die bei unterschiedlichen Wellenlängen aufgenommen wurden, werden Mehrwellenlängenscan genannt. Diese dienen dazu die optimale Wellenlänge für eine unbekannte Probe zu ermitteln. Zudem ist es möglich, Spektren (Absorption oder Fluoreszenz) einzelner Spots zu erstellen und darüber die Substanzidentifizierung zu erleichtern.